无论是牙周炎导致的牙槽骨吸收还是外伤造成的颌面骨缺损，治疗的关键都是骨组织的修复。然而，人体的骨骼与神经一样，通常并不具备强大的再生能力，因此临床上对于体积较大、难以自愈的骨缺损主要通过两种途径来治疗：一是自体/异种骨移植，二是3D打印生物支架及钛合金植入。前者存在创伤、移植后存活困难、排异（异种骨移植），后者则面临操作复杂、生物相容性不佳、有时需二次手术等问题。因此，如何唤起人体骨骼的再生机能，临床医生和科研人员一直孜孜以求。
日前，这条艰辛的探索之路有了新的突破——复旦大学附属口腔医院刘月华教授和复旦大学高分子科学系俞麟教授率领的团队发现，间充质干细胞（MSCs）经低氧处理得到低氧细胞外囊泡（Hypo-EVs），该囊泡再结合生物活性水凝胶，可显著促进颅骨成骨细胞的形成、分化以及局部血管的生成与分化，从而实现骨骼的再生。相关研究论文“Versatile Hypoxic Extracellular Vesicles laden in an Injectable and Bioactive Hydrogel for Accelerated Bone Regeneration”刊载于国际知名学术期刊Advanced Functional Materials（Adv. Funct. Mater. 2023, 33, 2211664）。复旦大学附属口腔医院邓佳佳博士研究生和高分子科学系王欣博士研究生为该文章共同第一作者，复旦大学附属口腔医院刘月华教授、於丽明医生和复旦大学高分子科学系俞麟教授为本文共同通讯作者。
“干细胞”早已成为生物医学研究领域的热词，作为一种“原始”形态的细胞“鼻祖”，具有分化成人体各类各型细胞的潜力。如何将潜力变成现实，医学工作者始终在探索。
间充质干细胞（MSCs）是一种研究广泛的具有自我更新和多向分化能力的多能干细胞。其中，骨髓源性间充质干细胞（BMSCs）在骨重塑中起着至关重要的作用。然而，由于干细胞移植到体内后细胞活力降低，分化能力受损以及潜在的免疫排斥和肿瘤形成等风险，限制了在骨再生中的应用及其临床转化。
越来越多的研究表明，MSCs的治疗作用主要通过旁分泌机制，来源于MSCs的细胞外囊泡（EVs）在其中扮演着关键角色。在正常生理条件下，骨髓中的氧浓度只有1%～6%，这意味着体内的BMSCs实际处于乏氧的微环境中。此前一直不清楚低氧预处理是否能够改善BMSCs来源的EVs功能，是否更有利于骨缺损的修复，直到刘月华、俞麟教授团队的最新发现，低氧处理的确能够促进颅骨成骨细胞的增殖、迁移和分化。
生物活性水凝胶负载Hypo-EVs促进骨修复的示意图
团队聚焦低氧处理对BMSCs生物学行为的影响以及EVs分泌的调节作用及其机制展开了深入研究，并考察其在标准颅骨损伤模型中的修复效果。研究人员首先确定了低氧处理细胞的氧浓度，证实1%O₂处理对BMSCs的活性无损伤作用，且转录组数据表明低氧处理还显著上调了干细胞内与EVs分泌、细胞外基质（ECM）形成、成骨分化和成血管分化等相关基因的表达。随后，研究人员通过超速离心法获得了Hypo-EVs，并发现低氧处理显著促进了Hypo-EVs的分泌，提高了Hypo-EVs中的蛋白含量。为了研究这种Hypo-EVs的生物学功能，研究人员分离提取了颅骨成骨细胞（ROBs），通过大量体外实验证实Hypo-EVs能够显著促进ROBs增殖、迁移和成骨分化。进一步的蛋白组学分析显示，Hypo-EVs有可能通过PI3K/AKT的信号通路来促进ROBs的成骨表型，最终通过使用AKT抑制剂确认了之前的推断。
为保持EVs在体内的生物活性并实现持续的递送，研究人员开发了一种由聚乙二醇-聚多肽共聚物组成的可注射生物活性水凝胶。体外细胞实验证实该水凝胶材料具有促进ROBs和BMSCs增殖的活性。体内实验显示这种聚多肽水凝胶具有良好的生物相容性和适宜的降解性能，能够很好地匹配体内骨缺损的修复过程。随后，研究人员将负载了Hypo-EVs的聚多肽水凝胶注射到大鼠5 mm直径的颅骨缺损区，通过Micro-CT观测和组织学检测确认Hypo-EVs在体内的持续释放结合水凝胶本身的生物活性加速了缺损部位的骨再生。
由于EVs内富含多种蛋白质，为了确定这些蛋白在骨再生中的作用，研究人员通过蛋白组学技术分析了EVs内蛋白表达差异。结果表明，Hypo-EVs内与成骨分化相关的多种蛋白高表达，其中一个高表达的蛋白是与ECM相关的蛋白多糖Bgn。研究人员通过Bgn过表达和敲降的细胞实验进一步证实Bgn蛋白是一个调节成骨细胞分化和矿化的关键蛋白。该研究阐明了Hypo-EVs在骨修复中的积极作用，首次揭示Bgn蛋白通过旁分泌机制参与了骨缺损的修复。
Hypo-EVs通过激活PI3K/AKT信号通路促进成骨细胞功能
综上所述，该项研究不仅揭示了BMSCs来源的Hypo-EVs在骨修复中的作用，而且开发了一种能够增强EVs治疗效果的递送平台。同时，由于其操作简便，可注射的热敏水凝胶成胶温度与体温接近，以及具备填充不规则缺损的塑形能力和密封伤口的优点，该治疗策略将有望应用到复杂且不规则的牙槽骨缺损模型中，成为非细胞治疗的一个典范。
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202211664
